Применение секвенирования по Сэнгеру в этиологической диагностике бактериальных осложнений в стационаре

Актуальность. Необходимость точной видовой идентификации микроорганизмов, вызывающих инфекционные осложнения у госпитализированных пациентов, в современном здравоохранении не вызывает сомнений. Цель. Определение возможности применения секвенирования по Сенгеру при рутинном микробиологическом обследовании пациентов в клинике внутренних болезней для повышения качества этиологической диагностики бактериальных осложнений. Материал и методы. Исследовали клинические изоляты микроорганизмов, выделенных у пациентов многопрофильного медицинского центра. Применяли классические микробиологические методы посева и идентификации культур, секвенирование по Сэнгеру. Результаты. Идентификация по Сэнгеру с применением системы MicroSeq (Applied Biosystems, США) обеспечила идентификацию всех 231 исследованных изолятов бактерий — возбудителей нозокомиальных инфекций. Для дифференциальной диагностики стрептококков и коагулазонегативных стафилококков в некоторых случаях, когда известные последовательности первых 500 нуклеотидов гена 16S рРНК двух видов различались на 1–2 нуклеотида, повышение дискриминационного уровня видовой идентификации до 100% позволяло провести валидное определение видовой принадлежности изучаемого микроорганизма. Фенотипические методы не позволили выявить значительную часть видов (25,9%) возбудителей нозокомиальных инфекций и лишь 8 (13,8%) из них идентифицировали достоверно во всех случаях. Применение секвенирования по Сэнгеру для идентификации бактерий привело к долговременному эффекту, связанному с повышением квалификации врачей-лаборантов, улучшением дискриминационных возможностей визуальной оценки макроморфологии бактериальных культур, что важно для выявления всех видов микроорганизмов, присутствующих в биосубстратах. Заключение. Метод секвенирования по Сэнгеру является высокоэффективным и достаточно экономичным, по сравнению с широко применяемыми в клинической практике панелями биохимических тестов, методом «золотого стандарта» в этиологической диагностике бактериальных осложнений в клинике внутренних болезней.

1. Cocquyt T., Zhou Z., Plomp J., van Eijck L. Neutron tomography of Van Leeuwenhoek's microscopes. Sci Adv. 2021; 7 (20): eabf2402. doi: 10.1126/sciadv.abf2402.

2. Wollman A. J., Nudd R., Hedlund E. G., Leake M.C. From Animaculum to single molecules: 300 years of the light microscope. Open Biol. 2015; 5 (4): 150019. doi: 10.1098/rsob.150019.

3. Escobar-Zepeda A., Vera-Ponce de León A., Sanchez-Flores A. The road to metagenomics: from microbiology to dna sequencing technologies and bioinformatics. Front Genet. 2015; 6: 348. doi: 10.3389/fgene.2015.00348.

4. Watson J., Crick F. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 1953; 171: 964–967/ doi: 10.1038/171964b0.

5. Tan S. Y., McCoy A. N. James Dewey Watson (1928): Co-discoverer of the structure of DNA. Singapore Med J. 2020; 61 (10): 507–508. doi: 10.11622/smedj.2020145.

6. Maguin P., Marraffini L. A. From the discovery of DNA to current tools for DNA editing. J Exp Med. 2021; 218 (4): e20201791. doi: 10.1084/jem.20201791.

7. Heather J. M., Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 2016; 107 (1): 1–8. doi: 10.1016/j.ygeno.2015.11.003.

8. Shendure J., Balasubramanian S., Church G. M., Gilbert W., Rogers J., Schloss J. A. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 9; 550 (7676): 345–353. doi: 10.1038/nature24286.

9. Crossley B. M., Bai J., Glaser A., Maes R., Porter E., Killian M. L. et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. J Vet Diagn Invest. 2020; 32 (6): 767–775. doi: 10.1177/1040638720905833.

10. Brooks H. J. Modern microbiology — a quiet revolution with many benefits. Australas Med J. 2013; 6 (7): 378–381. doi: 10.4066/AMJ.2013.1830.

11. Fuchs V. R. New priorities for future biomedical innovations. N Engl J Med. 2010; 363: 704–706. doi: 10.1056/NEJMp0906597.

12. Mishra S. Does modern medicine increase life-expectancy: Quest for the Moon Rabbit? Indian Heart J. 2016; 68 (1): 19–27. doi: 10.1016/j.ihj.2016.01.003.

13. Ranabhat C. L., Atkinson J., Park M. B., Kim C. B., Jakovljevic M. The Influence of universal health coverage on Life Expectancy at Birth (LEAB) and Healthy Life Expectancy (HALE): a multi-country cross-sectional study. Front Pharmacol. 2018; 9: 960. doi: 10.3389/fphar.2018.00960.

14. Miller J. M., Binnicker M. J., Campbell S., Carroll K. C., Chapin K. C., Gilligan P. H. et al. A guide to utilization of the microbiology laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2018 update by the infectious diseases society of America and the American society for microbiology. Clin Infect Dis. 2018; 67 (6): e1–e94. doi: 10.1093/cid/ciy381.

15. Peker N., Garcia-Croes S., Dijkhuizen B., Wiersma H. H., van Zanten E., Wisselink G. et al. A comparison of three different bioinformatics analyses of the 16S-23S rRNA encoding region for bacterial identification. Front Microbiol. 2019; 10: 620. Published 2019 Apr 16. doi: 10.3389/fmicb.2019.00620.

16. Barantsevich N. E., Vetokhina A. V., Ayushinova N. I., Orlova O. E., Barantsevich E. P. Candida auris bloodstream infections in Russia. Antibiotics (Basel). 2020; 9 (9): 557. doi: 10.3390/antibiotics9090557.

17. Wayne L. G., Brenner D. J., Colwell R., Grimont P., Krichevsky M., Moore L. H., et al. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. International Journal of Systematic Bacteriology. 1987; 37 (4): 463–464. doi: 10.1099/00207713-37-4-463.

18. Bergey D. H., Holt J. G. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 2000.

19. CLSI Performance Standards For Antimicrobial Susceptibility Testing. 29th Ed. CLSI guideline M100. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. 2019.

20. Sicheritz-Pontén T., Andersson S. G. A phylogenomic approach to microbial evolution. Nucleic Acids Res. 2001; 29 (2): 545–552. doi: 10.1093/nar/29.2.545.

21. Romalde J. L., Balboa S., Ventosa A. Editorial: microbial taxonomy, phylogeny and biodiversity. Front Microbiol. 2019; 10: 1324. doi: 10.3389/fmicb.2019.01324.

22. Palmer M., Steenkamp E. T., Coetzee M. P. A., Blom J., Venter S. N. Genome-based characterization of biological processes that differentiate closely related bacteria. Front Microbiol. 2018; 9: 113. doi: 10.3389/fmicb.2018.00113.

23. Bishop C. J., Aanensen D. M., Jordan G. E., Kilian M., Hanage W. P., Spratt B.G. Assigning strains to bacterial species via the internet. BMC Biol. 2009; 7: 3. doi: 10.1186/1741-7007-7-3.

24. Hanage W. P., Kaijalainen T., Herva E., Saukkoriipi A., Syrjänen R., Spratt B. G. Using multilocus sequence data to define the pneumococcus. J Bacteriol. 2005; 187 (17): 6223–6230. doi: 10.1128/JB.187.17.6223-6230.2005.

25. Hoshino T., Fujiwara T., Kilian M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. J Clin Microbiol. 2005; 43 (12): 6073–6085. doi: 10.1128/JCM.43.12.6073-6085.2005.

26. Jensen A., Kilian M. Delineation of Streptococcus dysgalactiae, its subspecies, and its clinical and phylogenetic relationship to Streptococcus pyogenes. J Clin Microbiol. 2012; 50 (1): 113–126. doi: 10.1128/JCM.05900-11.

27. Агеевец В. А., Сулян О. С., Авдеева А. А., Чулкова П. С., Гостев В. В., Агеевец И. В., и др. Сравнительная активность карбапенемных антибиотиков в отношении грамотрицательных продуцентов карбапенемаз различных групп. Антибиотики и химиотер. 2022; 67 (1– 2): 9–15. doi: https://doi.org/10.37489/0235-2990-2022-67-1-2-9-15.

28. Hou T. Y., Chiang-Ni C., Teng S. H. Current status of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical microbiology. J Food Drug Anal. 2019; 27 (2): 404–414. doi: 10.1016/j.jfda.2019.01.001.

29. Lin J. F., Ge MC, Liu T. P., Chang S. C., Lu J. J. A simple method for rapid microbial identification from positive monomicrobial blood culture bottles through matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry. J Microbiol Immunol Infect. 2018; 51 (5): 659– 665. doi: 10.1016/j.jmii.2017.03.005.

30. Tran A., Alby K., Kerr A., Jones M., Gilligan P. H. Cost savings realized by implementation of routine microbiological identification by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 2015; 53 (8): 2473–2479. doi: 10.1128/JCM.00833-15.

31. Elbehiry A., Aldubaib M., Abalkhail A., Marzouk E., Albeloushi A., Moussa I. et al. How M.A.LDI-TOF mass spectrometry technology contributes to microbial infection control in healthcare settings. Vaccines (Basel). 2022; 10 (11): 1881. doi: 10.3390/vaccines10111881.

32. Баранцевич Е. П., Баранцевич Н. Е. Применение MALDI-TOF массспектрометрии в клинической микробиологии. Трансляционная медицина. 2014; 3: 23–28. doi: https://doi.org/10.18705/2311-4495-2014-0-3-23-28.

33. Calderaro A., Chezzi C. MALDI-TOF MS: A reliable tool in the real life of the clinical microbiology laboratory. Microorganisms. 2024; 12 (2): 322. doi: https://doi.org/10.3390/microorganisms12020322.

34. Morel F., Jacquier H., Desroches M., Fihman V., Kumanski S., Cambau E., et al. Use of Andromas and Bruker M.A.LDI-TOF MS in the identification of Neisseria. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2018; 37 (12): 2273–2277. doi: 10.1007/s10096-018-3368-6.

35. Nybakken E. J., Oppegaard O., Gilhuus M., Jensen C. S., Mylvaganam H. Identification of Streptococcus dysgalactiae using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry; refining the database for improved identification. Diagn Microbiol Infect Dis. 2021; 99 (1): 115207. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2020.115207.

36. Mörtelmaier C., Panda S., Robertson I., Krell M., Christodoulou M., Reichardt N., et al. Identification performance of MALDI-ToF-MS upon monoand bi-microbial cultures is cell number and culture proportion dependent. Anal Bioanal Chem. 2019; 411 (26): 7027–7038. doi: 10.1007/s00216-019-02080-x.

37. Hong E., Bakhalek Y., Taha M.K. Identification of Neisseria meningitidis by MALDI-TOF MS may not be reliable. Clin Microbiol Infect. 2019; 25 (6): 717–722. doi: 10.1016/j.cmi.2018.09.015.

38. Chen L., Gao W., Tan X., Han Y., Jiao F., Feng B., Xie J., Li B., Zhao H., Tu H., Yu S., Wang L. MALDI-TOF MS is an effective technique to classify specific microbiota. Microbiol Spectr. 2023; 11: e00307–23. doi: https://doi.org/10.1128/spectrum.00307-23.

39. Yang Y., Lin Y., Qiao L. Direct M.A.LDI-TOF MS Identification of Bacterial Mixtures. Anal Chem. 2018; 90 (17): 10400–10408. doi: 10.1021/acs.an-alchem.8b02258.

40. Prakash S., Racovita A., Petrucci T., Galizi R., Jaramillo A. qSanger: quantification of genetic variants in bacterial cultures by sanger sequencing. Biodes Res. 2023; 5: 0007. doi: 10.34133/bdr.0007.

41. Tewolde R., Dallman T., Schaefer U., Sheppard C. L., Ashton P., Pichon B., et al. MOST: a modified MLST typing tool based on short read sequencing. Peer J. 2016; 4: e2308. doi: https://doi.org/10.7717/peerj.2308.

42. Nutman A., Marchaim D. How to: molecular investigation of a hospital outbreak. Clin Microbiol Infect. 2019; 25 (6): 688–695. doi: 10.1016/j.cmi.2018.09.017.

43. Баранцевич Е. П., Баранцевич Н. Е., Шляхто Е.В. Продукция карбапенемаз нозокомиальными штаммами K. pneumoniae в Санкт- Петербурге. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2016; 18 (3): 196–199.