Изучение динамики перехода в некультивируемое состояние антибиотикоустойчивых клеток Escherichia coli

Актуальность. Известно, что в ответ на присутствие антибиотиков бактерии вырабатывают устойчивость к их действию и стремятся сохранить её на длительный срок. Кроме того, микробы могут сохранять жизнеспособность, переходя в некультивируемое состояние, не выявляемое микробиологическими методами. Это состояние популяции характеризуется устойчивостью клеток к разным стрессам, в том числе к воздействию антибиотиков.
Цель. Изучить параметры процесса перехода в некультивируемое состояние у клеток Escherichia coli М-17, устойчивых к антибиотику.
Материал и методы. Резистентные клетки E.coli M17 получали культивированием исходной популяции в средах с повышающимися концентрациями ампициллина (до 50 мкг/мл). Из чувствительного и резистентного субштаммов готовили посевные культуры, из которых клетки переносили в гиперосмотическую, «голодную» среду — искусственную морскую воду. Полученные популяции инкубировали в течение длительного времени, периодически отбирая пробы для оценки параметров жизнеспособности.
Результаты. В опытах по длительной инкубации чувствительной и резистентной популяций E.coli M-17 обнаружено, что ампициллинорезистентный субштамм исследуемой культуры переходил в некультивируемое состояние достоверно быстрее и количественно больше, чем его чувствительный вариант. Присутствие антибиотика в посевной культуре (R2) увеличивало сроки перехода устойчивых бактерий в жизнеспособное некультивируемое состояние до уровня >90% по сравнению с посевной культурой без антибиотика (R1). В среде без антибиотика популяция R1 в начале стрессового воздействия массово (до 77,7%) переходила в жизнеспособные некультивируемые клетки. При наблюдении отмечены периоды отмирания клеток, которые становились субстратом для живой части популяции и могли приводить к вторичному росту бактерий или частичному восстановлению дормантных клеток.
Заключение. Клетки, резистентные к антибиотику, быстрее переходили в некультивируемое состояние по сравнению с чувствительными клетками исследованного штамма. Добавление антибиотика в среду для получения посевной культуры замедляло переход клеток в некультивируемое состояние.

1. WHO. Lack of new antibiotics threatens global efforts to contain drugresistant infections. World Health Organization, 2020.

2. Cai Y., Jianying L., Guiying L., Keung P., An W. T. Formation mechanisms of viable but nonculturable bacteria through induction by light-based disinfection and their antibiotic resistance gene transfer risk: A review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2021. https://doi.org/10.1080/10643389.2021.1932397.

3. Chang P. H., Juhrend B., Olson T. M., Marrs C. F., Wigginton K. R. Degradation of extracellular antibiotic resistance genes with UV254 treatment. Environmental Science & Technology. 2017; 51 (11): 6185–6192. https://doi.org/10.1021/acs.est.7b01120

4. Prestinaci F., Pezzotti P., Pantosti A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathog Glob Health. 2015; 109 (7): 309–318. doi: 10.1179/2047773215Y.0000000030.

5. Band V. I., Hufnagel D. A., Jaggavarapu S., Sherman E. X., Wozniak J. E., Satola S. W. et al. Antibiotic combinations that exploit heteroresistance to multiple drugs effectively control infection. Nat Microbiol. 2019; 4 (10): 1627–1635. doi: 10.1038/s41564-019-0480-z .

6. Liu, Y.-Y. Wang Y., Walsh T. R., Yi L.-X., Zhang R., Spencer J. et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: A microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis. 2016; 16 (2): 161–168. doi: 10.1016/S1473-3099(15)00424-7.

7. McKenna M. The antibiotic paradox: Why companies can’t afford to create life-saving drugs. Nature. 2020; 584 (7821): 338–341. doi: 10.1038/d41586-020-02418-x.

8. Peterson E. Antibiotic resistance mechanisms in bacteria: Relationships between resistance determinants of antibiotic producers, environmental bacteria, and clinical pathogens. Front microbiol. 2018; 9: 2928. doi: 10.3389/fmicb.2018.02928.eCollection 2018.

9. Reineke K., Mathys A. Endospore inactivation by emerging technologies: A review of target structures and inactivation mechanisms. Ann Rev Food Sci Technol. 2020; 11 (1): 255–274. doi: 10.1146/annurev-food-032519-051632.

10. Wormer L., Hoshino T., Bowles M. W., Viehweger B., Adhikari R. R., Xiao N. Microbial dormancy in the marine subsurface: Global endospore abundance and response to burial. Sci Adv. 2019; 5 (2): eaav1024. doi: 10.1126/sciadv.aav1024.

11. Pakhomov Yu. D. Blinkova L. P., Dmitrieva O. V., Berdyugina O. S., Skorlupkina N. N. Factors for conversion of nonculturable probiotic bacteria into active state. Journal of Nature Science and Sustainable Technology. 2016; 10 (1): 147–153.

12. Pakhomov Yu.D., Blinkova L.P., Abdullaeva A.M., Valitova R.K., Karachina T.A. Induction and resuscitation of viable but nonculturable bacteria from different taxonomic groups Gorteria Journal. 2020; 34 (4): 229–235.

13. Bodor A., Bounedjoum N., Vincze G. E., Kis A.E., Laczi K., Bende G. et al. Challenges of unculturable bacteria: Environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and BioTechnology. 2020; 19 (1): 1–22. https://doi.org/10.1007/s11157-020-09522-4.

14. Dong K., Pan H., Yang D., Rao L., Zhao L., Wang Y. et al. Induction, detection, formation, and resuscitation of viable but non-culturable state microorganisms. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2020; 19 (1): 149–183. doi: 10.1111/1541-4337.12513.

15. Fu Y., Jia Y., Fan J., Yu C., Shen C. Induction of Escherichia coli O157: H7 into a viable but non-culturable state by high temperature and its resuscitation. Environ Microbiol Rep. 2020; 12 (5): 568–577. doi: 10.1111/1758-2229.12877.

16. Masuda Y. Tajima K., Ezura Y. Resuscitation of Tenacibaculum sp., the causative bacterium of spotting disease of sea urchin Strongylocentroutus intermedius from viable but non–culturable state. Fisheries Science. 2004; 70 (2): 277–284.

17. Карачина Т.А. Блинкова Л.П., Абдуллаева А.М., Валитова Р.К., Пахомов Ю.Д. Действие фагов на бактерии в некультивируемом состоянии. Проблемы медицинской микологии. 2021; 23 (2): 85–86. [Karachina T.A., Blinkova L.P., Abdullaeva A.M., Valitova R.K., Pakhomov Yu.D. Effects of phages on bacteria in nonculturable state. Problemy Meditsinskoi Mikologii. 2021; 23 (2): 85–86. (in Russian)]

18. Skorlupkina N., Blinkova L., Pakhomov Yu, Piyadina A., Chistaykova D. Formation and reversion of VBNC cells of Salmonella Typhimurium preincubated in different substrates. International Journal of Current Reseach and Review. 2017; 9 (9): 20–25

19. Ayrapetyan M., Williams T., Oliver J.D. Relationship between the viable but nonculturable state and antibiotic persister cells. J Bacteriol. 2018; 200 (20): e00249–18. doi: 10.1128/JB.00249-18.